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磁分離酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測FSH、LH和hCG
（作者未知） 2010/8/19
【關(guān)鍵詞】 磁分離酶 FSH LH hCG
磁分離酶聯(lián)免疫技術(shù)是80年代中期瑞士Serono(史朗洛)診斷中心發(fā)明的一種非同位素免疫檢測的先進(jìn)技術(shù)，稱為磁性抗體免疫技術(shù)(MAIA)。使雙抗體夾心酶聯(lián)免疫技術(shù)在游離型標(biāo)記抗體和標(biāo)記抗原-抗體復(fù)合物分離中具有分離完全和快速的優(yōu)點(diǎn)，也為磁性分離技術(shù)的推廣創(chuàng)造了條件。我們采用該中心發(fā)明的SEROZYME酶聯(lián)免疫雙抗體夾心檢測系統(tǒng)(由酶聯(lián)免疫內(nèi)分泌定量測定儀和配套試劑盒組成一個(gè)完整的檢測系統(tǒng))，分析測定FSH、LH和hCG，將檢測的結(jié)果報(bào)告如下。
1 實(shí)驗(yàn)原理
待測物(FSH、LH和hCG)分別用堿性磷酸酶(ALP)和異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的單克隆抗體反應(yīng)形成酶標(biāo)抗體．抗原-FITC標(biāo)記抗體的復(fù)合物，即雙抗體夾心，再加磁性分離劑(含有與抗FITC結(jié)合的磁性微粒)使復(fù)合物與磁性微粒結(jié)合，在永久磁體吸引下使其沉淀至管底，分離酶標(biāo)抗體，加入底物單磷酸酚酞(PMP)，ALP催化PMP水解釋放出酚酞，在pH為10．5的緩沖液中呈桃紅色，再以永久磁體吸引磁性復(fù)合物使其沉淀，上清液置SEROZYME-I型酶聯(lián)免疫內(nèi)分泌定量測定儀測定。
2 材料與方法
2.1儀器
SEROZYME-I型酶聯(lián)免疫內(nèi)分泌定量測定儀(三波長492 nm、550 nm、630 nm同時(shí)檢測，程序編輯，曲線繪制，微機(jī)控制，打印輸出)，磁性分離器和混勻器(由北京倍愛康生物技術(shù)有限公司提供)。
2.2試劑
FSH、LH和hCG SEROZYME試劑盒。內(nèi)容包括：FITC和牛ALP標(biāo)記鼠抗人hCG、FSH和LH單克隆抗體，F(xiàn)SH、LH和hCG系列標(biāo)準(zhǔn)液，磁分離試劑，清洗濃縮液，基質(zhì)液，稀釋緩沖液和終止液。
2.3檢測標(biāo)本
臨床病人，空腹采血。
2.4檢測方法
按試劑盒說明書進(jìn)行操作。先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，復(fù)管測定，用SEROZYME-I型酶聯(lián)免疫定量測定儀對FSH、LH和hCG進(jìn)行定量程序測定，自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將數(shù)據(jù)貯存入相應(yīng)的定量程序中。然后以同樣方法檢測待測標(biāo)本，各管用儀器直接測定讀數(shù)。
分為4個(gè)步驟：
(1)抗原抗體反應(yīng)：加入待測血清及反應(yīng)試劑37℃水浴保溫15分鐘，使其形成抗原抗體復(fù)合物。
(2)磁性分離：加入磁分離試劑，使磁性顆粒與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，在磁場的作用下沉淀復(fù)合物，洗滌，沉淀?xiàng)壢ノ捶磻?yīng)的試劑。
(3)顯色反應(yīng)：加入基質(zhì)單磷酸酚酞，使結(jié)合在免疫復(fù)合物上的酶遇到相應(yīng)的底物時(shí)，發(fā)生催化反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)酚酞，加入終止液，該液顯桃紅色。顏色反應(yīng)的深淺與相應(yīng)的抗體或抗原量成正比。因此，可以借助于顏色反應(yīng)的深淺來定量測定抗體或抗原的量。
(4)讀出結(jié)果：將已顯色的標(biāo)準(zhǔn)管和測定管嚴(yán)格按操作程序在SEROZYME-I型酶聯(lián)免疫定量測定儀上直接讀取結(jié)果，每秒測一管。
3 結(jié)果
3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(線性范圍)
各標(biāo)準(zhǔn)液濃度相對應(yīng)的吸光度在儀器經(jīng)對數(shù)處理后，線性良好。hCG濃度在0～500 mIU/mL，F(xiàn)SH在0～150mIU/mL，LH在0～200 mIU/mL范圍內(nèi)與吸光度成線性關(guān)系。
3.2顯色穩(wěn)定性試驗(yàn)
空白對照(底物液+終止液)和測定管(酶標(biāo)抗體+底物+終止液)在加終止液后，在不同時(shí)間內(nèi)(1分鐘，5分鐘，10分鐘，20分鐘，30分鐘，1小時(shí)，2小時(shí)，4小時(shí)，6小時(shí)，和24小時(shí))觀察其吸光度(550hm)變化。
4 討論
在雙抗體夾心酶聯(lián)免疫測定法(MAIA)中，分離游離型標(biāo)記抗體和標(biāo)記抗體-抗原復(fù)合物是一重要環(huán)節(jié)。分離方法有多種，其中磁性分離技術(shù)具有分離完全而快速的優(yōu)點(diǎn)，但因磁性抗體免疫試劑制備困難而限制了該技術(shù)的推廣。瑞士Serono診斷中心發(fā)明這種磁性抗體免疫技術(shù)，稱MAIA，為酶聯(lián)免疫分析中磁性分離技術(shù)的推廣和應(yīng)用創(chuàng)造了條件。Serono磁性分離試劑用抗熒光素標(biāo)抗體與直徑1μm的粒子結(jié)合成為磁性微�？篃晒馑乜贵w，它是一種非同位素免疫檢測系統(tǒng)。由于抗原抗體反應(yīng)在液相中進(jìn)行，不僅反應(yīng)速度快，而且均勻，時(shí)間明顯短于固相分離。
我們對該方法在線性范圍、顯色穩(wěn)定性、精密度和精確度等方面進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果顯示：標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍較寬，重復(fù)性良好；儀器能儲(chǔ)存前次測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)，不需要每次作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以進(jìn)行急診標(biāo)本的檢測，整個(gè)檢測過程僅需1～2小時(shí)。我們在1天24小時(shí)不同時(shí)間內(nèi)觀察空白管和測定管的吸光度變化，結(jié)果為空白管吸光度的變異系數(shù)為0．023，測定管吸光度的（未完，下一頁）
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