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文獻綜述 犬瘟熱病毒（CDV）的分子特征及其分離方法
（作者未知） 2011/3/14
（接上頁）重要。
3 犬瘟熱病毒的分離
病毒分離是病毒研究的第一步。CDV負(fù)鏈RNA病毒抵抗力不強，對熱、干燥、紫外線和有機溶劑敏感，易為日光、酒精、乙醚、甲醛與煤酚皂等滅活。在炎熱季節(jié)，CDV在犬群中不能長期存活，這可能是犬瘟熱多流行于冬春寒冷季節(jié)的原因。病毒不易存活本是好事，但是給病毒的分離帶來了不便。此外，病料采集的部位、時間、樣品處理、發(fā)病動物的抗病毒抗體水平等因素對病毒分離成功與否也有一定的影響，但最主要的是分離病毒的細(xì)胞是否敏感和有效。因此，選擇適合培養(yǎng)的細(xì)胞是關(guān)鍵。目前，分離犬瘟熱病毒用的組織細(xì)胞主要分為原代細(xì)胞及傳代細(xì)胞系兩大類。
3.1 原代細(xì)胞分離CDV
分離犬瘟熱病毒的原代細(xì)胞有犬或貂的肺和腹腔巨噬細(xì)胞、腎細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、犬腦細(xì)胞、犢牛的腎細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞、牛胚胎肺細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)[5]。雞胚的絨膜囊可以用于少量病毒的分離，但要求幾周連續(xù)接新的雞胚，才可以產(chǎn)生明顯的CPE，造價比較高[6]。用雪貂腹腔巨噬細(xì)胞成功分離到了CDV[7]。最有效的方法是用幼犬或雪貂的肺巨噬細(xì)胞進行培養(yǎng)。Vantsis用感染動物的肺巨噬細(xì)胞直接培養(yǎng)，可以頻繁地分離出病毒[8]。沒有母源抗體的易感的犬的肺巨噬細(xì)胞對該病毒最易感，可形成典型的細(xì)胞病變（CPE）。
3.2 傳代細(xì)胞分離CDV
分離犬瘟熱病毒的傳代細(xì)胞系有犬腎細(xì)胞系（MDCK）、貓胚胎細(xì)胞系（FE）、貓腎細(xì)胞系（CRFK）、乳倉鼠胎腎細(xì)胞系（BHK-21）、非洲綠猴腎細(xì)胞系（Vero）及其克隆株（Vero E6）、BGMK細(xì)胞系、絨猴B淋巴細(xì)胞系(B95a)、人子宮頸癌細(xì)胞系(Hela)、人喉頭癌細(xì)胞系(HEP-2)、CV-1(Tc7 clone)細(xì)胞系、Bsc-1細(xì)胞系、兔腎細(xì)胞系(RK13)、BD細(xì)胞系等。近年來，用Vero細(xì)胞分離培養(yǎng)CDV很有希望，被認(rèn)為是首選細(xì)胞[9]。已有用Vero和CRFK成功分離出犬瘟熱病毒的報道[5]。
用原代細(xì)胞分離CDV的優(yōu)點是能快速的分離并且很好的保持病毒特性，但是原代細(xì)胞傳代次數(shù)較少，對病毒培養(yǎng)不利。傳代細(xì)胞雖然克服了傳代次數(shù)的限制，能較好的分離得到犬瘟熱病毒，但是由于傳代細(xì)胞本身缺少CDV的受體——信號淋巴細(xì)胞激活因子（SLAM）和硫酸乙酰肝素（HS）, CDV不能與之很好的結(jié)合，從而限制了用傳代細(xì)胞對犬瘟熱的分離與培養(yǎng)。在CDV的體外研究中，習(xí)慣上用MDCK細(xì)胞和Vero細(xì)胞[10]，但這些細(xì)胞并不表達(dá)CDV感染的主要受體——信號淋巴細(xì)胞激活因子（SLAM）[11]，因此分離得到的野毒在這些細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)不明顯的細(xì)胞病變（CPE）[12]。同時有報道稱用Vero細(xì)胞培養(yǎng)的麻疹病毒使其病原性發(fā)生丟失，而用絨猴B淋巴細(xì)胞系(B95a)培養(yǎng)的始終保持其毒力[13]。B95a細(xì)胞是由絨猴B淋巴細(xì)胞，經(jīng)EB 病毒轉(zhuǎn)化表達(dá)絨猴的SLAM的一種細(xì)胞因轉(zhuǎn)化了信號淋巴細(xì)胞激活因子基因的絨猴B淋巴細(xì)胞系(B95a)可以很好的分離培養(yǎng)CDV且能出現(xiàn)明顯的CPE，為研究CDV開辟了好的方法， 但B95a細(xì)胞在培養(yǎng)過程中會分泌少量的EB 病毒的犬瘟熱病毒用于一般研究，不能用于新疫苗的研制；同時對實驗室的等級要求比較高，還對實驗人員存在潛在的危險。
3.4 構(gòu)建表達(dá)信號淋巴細(xì)胞激活因子的細(xì)胞系分離CDV
最近研究證實存在于多種動物（人、犬、牛）的細(xì)胞上的信號淋巴細(xì)胞激活因子（SLAM；CD150）為麻疹病毒屬中麻疹病毒，犬瘟熱病毒，牛瘟麻疹病毒及牛瘟病毒的受體[14]。麻疹病毒和犬瘟熱病毒同屬于麻疹病毒屬，兩者具有很近的親緣關(guān)系。SLAM是在淋巴細(xì)胞和樹突細(xì)胞表達(dá)的糖蛋白[15]，是麻疹病毒的受體。B95a上的SLAM可能是CDV的唯一受體[16]。這個受體分子能使由B95a細(xì)胞分離得麻疹病毒對其有抗性的細(xì)胞內(nèi)系內(nèi)[16]，并產(chǎn)生明顯的CPE。CDV以SLAM作為感染的受體，很好的解釋了病毒在細(xì)胞內(nèi)組織定位及其感染的淋巴細(xì)胞嗜性和造成感染宿主的機體免疫抑制等病理現(xiàn)象，但卻很難解釋CDV在感染宿主體內(nèi)肺臟、肝臟、胃腸道等非表達(dá)SLAM的組織細(xì)胞大量分布的現(xiàn)象。很可能在細(xì)胞上還存在一種CDV受體。Fujita等證實用抑制SLAM表達(dá)的293細(xì)胞（人胚上皮細(xì)胞）仍能感染CDV[17]，支持CDV識別不止一種受體。報道與CDV為同一屬的牛瘟麻疹病毒用硫酸乙酰肝素（HS）做為受體[18]。研究犬瘟熱病毒的H蛋白和F蛋白發(fā)現(xiàn)上面都有與肝素(HS的類似物)的結(jié)合位點[17]，而H蛋白和F蛋白是病毒侵染細(xì)胞所必需。但是HS與CDV得結(jié)合能力很弱，有的學(xué)者認(rèn)為它可能促進SLAM或CD46與病毒的結(jié)合從而促進病毒的感染。HS在動物細(xì)胞膜中（未完，下一頁）
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