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北五味子中4種木脂素類化合物的高效液相色譜法同時測定
（作者未知） 2011/4/25
（接上頁）溶液(二次蒸餾水∶乙腈=95∶5)沖洗色譜柱(注意此時應關閉檢測器)，最后用純乙腈沖洗約20 min，封柱，待用。
3結果與討論
3.1色譜柱的選擇由于本實驗欲分離的對象均為親脂性的物質，又因為反相化學鍵合色譜柱具有柱效高、重現性好、選擇性高、色譜柱壽命長、可進行梯度洗脫等優(yōu)點，可選用反相化學鍵合色譜法進行分析，而且反相色譜使用水作為流動相的主體能大大降低實驗成本[8,9]。為此本實驗選擇反相化學鍵合色譜柱，即C18柱為色譜分離柱。
3.2流動相體系的選擇本實驗分別考察了甲醇-水流動相體系和乙腈-水流動相兩種體系下，4種標準物質及其樣品的色譜分離情況，實驗得出，4種被測物質在相同配比的兩種體系下均能得到洗脫和分離，而應用甲醇-水體系分析時間長，后出峰物質的峰形變寬，而采用相同配比的乙腈-水體系可以大大縮短組分的保留時間，而且各物質的峰形尖銳，對稱度好。實驗結果表明樣品中的干擾物質很多，欲滿足分析要求，必須使各種物質有良好的分離度和洗脫效果，并且減少拖尾和包峰情況，應用乙腈-水體系能明顯抑制峰形變寬，而且乙腈-水體系溶劑強度大、黏度小，會使各物質的洗脫和分離效果更好。為此本實驗選擇乙腈-水為流動相體系。
3.3流動相配比及洗脫方式和洗脫程序的確定本實驗考察了樣品的色譜分離情況，樣品中的干擾物質很多，單純考慮標準物質的分離來確定流動相的配比已經不能滿足分離分析的要求，乙腈和水的配比調整為65∶35，此時標準物質已能達到很好的分離，但樣品中五味子醇甲和五味子酯甲與周圍的干擾物質仍然無法分開，而五味子甲素和五味子乙素的分配比較大，雖然已經彼此分離開且周圍干擾較少，但色譜峰變寬。由此可見欲使被測物質與其他的干擾物質達到良好的分離，就需降低流動相的洗脫強度，即減少流動相中乙腈的含量，這樣會導致五味子甲素和五味子乙素的洗脫時間延長，為此可采用梯度洗脫方式進行分離，先以低強度流動相洗脫[10]，即開始時乙腈含量較少，待五味子醇甲和五味子酯甲以理想的分離度彼此分開后，逐漸增加乙腈的含量，即增加流動相的洗脫強度，使強保留組分五味子甲素和五味子乙素能在合適的保留時間內以滿意的分離度從色譜柱中流出，從而提高分離效果，改變峰形，縮短分析時間[11]。為獲得最佳洗脫效果，實驗設計了4套梯度洗脫程序，考察了不同的梯度洗脫條件對各組分分離的影響。通過實驗得到，4號梯度洗脫程序的色譜圖中4種待測物質的分離效果最好，在分離效果良好的基礎上盡量縮短分析時間。因此，選擇4號梯度洗脫程序為最佳的梯度洗脫程序。如表1所示。表1最佳的梯度洗脫程序
3.4檢測波長的選擇進行高效液相色譜分析時經常采用的檢測器是紫外-可見檢測器，其優(yōu)點是靈敏度高，波長范圍寬，但只能在同一波長下檢測，對分析多種物質不能同時選擇每種物質的最大吸收波長[12]，這樣會使某些物質的檢測靈敏度降低。而本實驗采用DAD檢測器，該檢測器可以動態(tài)地快速掃描被測組分的紫外-可見吸收光譜圖，可直接得到每個物質的最大吸收波長，而且可在每個色譜峰出峰之前，動態(tài)調整檢測器波長，完全可以以每個組分的最大吸收波長作為檢測波長以此來提高檢測靈敏度，并能有效地減小基線漂移。實驗分別取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素標準溶液進樣分析，采用DAD檢測器于190～900 nm范圍內進行紫外光譜掃描。結果如圖1所示。圖14種組分的紫外-可見吸收光譜圖由4種組分的紫外-可見吸收光譜可以看出，五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素均在216 nm處有最大吸收峰，五味子酯甲在222 nm處有最大吸收峰。所以本實驗選擇五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的檢測波長為216 nm，五味子酯甲的檢測波長為222 nm。
3.5柱溫的選擇本實驗在上述確定的實驗條件下以流速0.8 ml/min，進樣量10 μl，分別在20，25，30，35，40 ℃進行柱溫選擇實驗，考察了柱溫對樣品中各物質分離度及理論塔板數的影響。實驗結果表明各種物質的分離度隨著柱溫的升高呈不同的變化趨勢，只有在20℃和25℃時各物質的分離度才大于1.0，可以滿足分析要求。實驗得出，在20℃和25℃時，五味子醇甲和五味子甲素的柱效變化不大，但五味子酯甲和五味子乙素柱效在25℃時最高，為此，本實驗選擇柱溫為25℃。
3.6流速的選擇由實驗中可以看出，流動相流速對4種組分的保留時間有一定的影響，隨著流速的增大，各組分的保留時間提前，分析效率提高。但當流動相流速過大時，系統(tǒng)的壓力太高，容易沖塌柱。當流速為0.8 ml/min時，五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的柱效達到最高，為此，本實驗采用0.8 ml/min為最佳流速。
3.7樣品前處理方法的確定
3.7.1提取方法、（未完，下一頁）
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