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銀杏葉提取物對腺樣囊性癌ACC-2細(xì)胞凋亡及Survivin、TIP30基因表達(dá)的影響
資源天下 2014/5/30 19:52:35
摘要 目的：探討銀杏葉提取物(EGB)對淚腺腺樣囊性癌ACC-2細(xì)胞增殖、凋亡及Survivin、TIP30基因表達(dá)的影響。方法：體外培養(yǎng)人淚腺腺樣囊性癌ACC-2細(xì)胞，應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞增殖；Annexin V/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期；RT-PCR和Western blotting分析Survivin、TIP30基因表達(dá)。結(jié)果：EGB對ACC-2細(xì)胞的體外增殖具有抑制作用，量效關(guān)系顯著，與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P﹤0.01，半數(shù)抑制濃度50%(IC50)為88 mg/L。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測表明，EGB能使ACC-2細(xì)胞G0-G1期逐漸增加，G2-M期和S期逐漸減少，并且隨著劑量的增加，ACC-2細(xì)胞凋亡率明顯增加(P﹤0.05或P﹤0.01)。EGB對ACC-2細(xì)胞Suivivn基因表達(dá)有一定的抑制作用，同時(shí)促進(jìn)TIP30基因的表達(dá)。隨著EGB濃度的升高，Survivin基因表達(dá)明顯減少(P﹤0.01)，而TIP30基因表達(dá)則顯著提高（P﹤0.01）。結(jié)論：EGB能有效抑制人淚腺腺樣囊性癌ACC-2細(xì)胞Survivin基因表達(dá)并促進(jìn)TIP30的表達(dá)，誘導(dǎo)ACC-2細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。
關(guān)鍵詞：銀杏葉提取物；ACC-2細(xì)胞；增殖；凋亡；Survivin基因；TIP基因
淚腺腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma, ACC)是淚腺惡性上皮性腫瘤中最為常見并且惡性程度最高的腫瘤，其發(fā)病率約占淚腺上皮性腫瘤的29%，僅次于多形性腺瘤，居于第2位 , 。其對常規(guī)放、化療不敏感，以手術(shù)治療為主，但由于該腫瘤生長具有較強(qiáng)的浸潤性，好沿神經(jīng)侵襲生長 ，手術(shù)無法根除，術(shù)后復(fù)發(fā)率高且遠(yuǎn)期療效較差，治療比較棘手。因此，探求新的治療方法已成為ACC研究的新方向。
銀杏葉提取物(extract of ginkgo biloba, EGB)對腫瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用，能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡 , ，并能增強(qiáng)化療藥物的抑瘤作用，但其對ACC的抗腫瘤作用及其機(jī)制研究尚未見報(bào)道。Survivin是近年新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制因子，通過抑制Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游的Caspase-3和Caspase-7活性，起到抑制細(xì)胞凋亡的作用，是目前腫瘤相關(guān)基因研究的熱點(diǎn)問題之一 , 。TIP30是一種抑癌基因，可特異性作用于HIV-I長末端重復(fù)序列的蛋白，具有抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞血管生成的作用。本研究通過觀察EGB對淚腺腺樣囊性癌ACC-2細(xì)胞增殖、凋亡及Survivin、TIP30基因表達(dá)的影響，探討EGB可能的抗腫瘤作用機(jī)制，為其進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 藥物與試劑
銀杏葉提取物（EGB761，商品名：金納多），德國威瑪舒培博士藥廠生產(chǎn)，批號(hào)：1140808。RT-PCR試劑盒購自德國Qiagen公司；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司；Survivin抗體、TIP30抗體購自美國Santa Cruz公司；RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司；MTT、二甲基亞砜、瓊脂糖購自美國Amresco公司；Trizol總RNA抽提試劑購自Invitrogen公司；Taq DNA聚合酶、Oligod、RNAsin購自美國Promage公司；引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。
1.2 細(xì)胞株
人淚腺腺樣囊性癌ACC-2細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。用含10%胎牛血清、2%的谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。
1.3 儀器設(shè)備
CO2培養(yǎng)箱(MCO175，SANYO)；倒置顯微鏡 (IX-70，Olympus)；水平流超凈工作臺(tái)(ZHJH-2112)；流式細(xì)胞儀 (FACS Calibur, Becton Dickinson)；PCR擴(kuò)增儀(Roche)；酶標(biāo)儀(ELX800型)。
1.4 方法
1.4.1 MTT法測定細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期的ACC-2細(xì)胞制成2×107•mL－1細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL，培養(yǎng)24h。然后加入EGB100μL，使其終濃度分別為0、10、20、40、80、160mg/L，同時(shí)設(shè)對照孔和調(diào)零孔，每組6個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入20μL MTT溶液(5g/L)，再培養(yǎng)4h后吸去全部上清液，然后每孔加入200μL二甲基亞砜，振蕩搖勻終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀在490 nm處測吸光度(A)值。計(jì)算腫瘤細(xì)胞增殖抑制率。
腫瘤細(xì)胞增殖抑制（未完，下一頁）
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