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銀杏葉提取物對腺樣囊性癌ACC-2細(xì)胞凋亡及Survivin、TIP30基因表達(dá)的影響
資源天下 2014/5/30 19:52:35
（接上頁）率=(對照組A值－藥物組A值)/對照組A值×100%
1.4.2 Annexin V/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 取對數(shù)生長期的ACC-2細(xì)胞制成1×106•mL－1細(xì)胞懸液，接種于12孔培養(yǎng)板中，每孔2mL，加入EGB使其終濃度分別為0、10、40、160 mg/L。培養(yǎng)48 h后，調(diào)整待測細(xì)胞濃度為1×106•mL－1，取1mL細(xì)胞懸液，1000 r/min 4℃離心10 min棄上清，加入1 mL冷PBS重懸細(xì)胞，再重復(fù)離心，棄上清，加入200μL結(jié)合緩沖液重懸，再加入10μL Annexin V-FITC、5μL PI，混勻，室溫避光孵育15 min，加入300μL結(jié)合緩沖液，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測細(xì)胞凋亡率并分析細(xì)胞周期。
1.4.3 RT-PCR檢測Survivin和TIP30 mRNA的表達(dá) 取對數(shù)生長期的ACC-2細(xì)胞，培養(yǎng)24h，加入EGB使其終濃度分別為0、10、40、160 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，電泳檢測RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板PCR擴(kuò)增Survivin，β-action為內(nèi)參照基因。Survivin上游引物5’-GGCACCAGAGGCAGTAACCA-3’，下游引物5’-GGACCTTCGGTGACTGATGATCTAA-3’；β-action上游引物5’-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游引物5’-AGTCTT- TCTGGGTGGCAGTGAT-3’。反應(yīng)條件為：首先95℃預(yù)變性5 min；然后94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。
以cDNA為模板PCR擴(kuò)增TIP30，β-action為內(nèi)參照基因。TIP30上游引物5’-GTCTTTATTTTGGGCGCCAG-3’，下游引物5’-CCCAGCTTTCCCTCTGGTGG-3’；β-action上游引物5’-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游引物5’-AGTCTT- TCTGGGTGGCAGTGAT-3’。反應(yīng)條件為：首先95℃預(yù)變性5 min；然后94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。分別取兩種基因的PCR產(chǎn)物12μL于2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察記錄結(jié)果。
1.4.4 Western blotting檢測Survivin、TIP30基因表達(dá) 取0、10、40、160mg/L EGB作用48 h后的ACC-2細(xì)胞，各收集1×107個細(xì)胞，加入200μL蛋白裂解液，于4℃裂解1h，12000 r/min 4℃ 離心20 min取上清，用考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)測定法測定蛋白濃度。取80μg樣品總蛋白變性10min后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，分離的蛋白帶電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，經(jīng)5%BSA 37℃封閉1 h，加入抗Survivin的單克隆抗體或抗TIP30的單抗4℃孵育16h，洗膜3次。再加入羊抗鼠二抗，37℃孵育1h，洗膜3次。化學(xué)發(fā)光顯色檢測分析結(jié)果。對蛋白條帶灰度進(jìn)行相對定量分析，并以β-action條帶作為參照。Survivin相對含量= Survivin灰度值/β-action灰度值，Survivin表達(dá)抑制率=1-藥物組Survivin相對含量/對照組Survivin相對含量；TIP30相對含量=TIP30灰度值/β-action灰度值。
1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以 ±s表示，采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 EGB對ACC-2細(xì)胞增殖的抑制作用
EGB不同濃度對ACC-2細(xì)胞的體外增殖均有一定的抑制作用，并且隨著EGB濃度的增高，抑制作用也在增強(qiáng)，量效關(guān)系顯著。各劑量組與對照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=11.67, 16.31, 22.01, 24.18, 26.68, P﹤0.01)；經(jīng) Logit方法計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)為88 mg/L。見表1。
2.3 Western blotting分析EGB對Survivin、TIP30基因表達(dá)的影響
隨著EGB濃度的升高，Survivin、TIP30基因表達(dá)明顯減少，量效關(guān)系明顯。見圖1。
圖1 Western blotting分析EGB對Survivin、TIP30基因表達(dá)的影響
2.4 EGB對ACC-2細(xì)胞Survivin、TIP30基因（未完，下一頁）
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