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抑肝纖及拆方對肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1，PAI-1蛋白表達的影響
（作者未知） 2010/5/25
（接上頁）
1.4 方法
1.4.1 動物分組、模型復(fù)制及給藥方法
48只大鼠在正式實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機分為6組，每組8只，即正常對照組、模型組、抑肝纖組、拆方組按中醫(yī)治則進行拆方分為丹參、川芎組、黃芪、白術(shù)組和鱉甲、牡蠣組。除正常對照組外，其余5組參照Wang等方法［3］略加改進，進行模型復(fù)制，40%四氯化碳（CCl4）花生油溶液大腿內(nèi)側(cè)皮下注射，0.3 ml/100 g體重,2次/周，正常對照組注射等量生理鹽水，持續(xù)8周。在造模8周后第2天起，各治療組分別給予相應(yīng)劑量（1 ml/100 g體重）的對應(yīng)藥物灌胃，1次/d。正常組與模型組按1 ml/100 g體重灌以蒸餾水，1次/d。共治療8周。
1.4.2 標本制備
治療8周末，于最后1次給藥后禁食12 h,斷頭處死所有動物，迅速剖取肝臟，每次在肝左葉相同部位上取1 cm×1 cm×1 cm大小組織塊，免疫組化標本固定于4%多聚甲醛和0.1%戊二醛混合固定液，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片。其余的肝組織立即于-70℃冰凍保存。
1.4.3 檢測指標
免疫組化SP法分別測定轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1），1-型纖溶酶原激活物抑制物（PAI-1）蛋白在大鼠肝組織內(nèi)的定位表達，并用北京航空航天大學(xué)CMIAS病理圖像分析系統(tǒng)檢測陽性表達的面密度。 檢測方法嚴格按照說明書操作。
1.5 統(tǒng)計學(xué)處理
計量資料的各變量均采用±s表示，應(yīng)用SPSS11.5 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）。組間兩兩比較用LSD法。
2 結(jié)果
2.1 肝組織TGF-β1 免疫組織化學(xué)染色及圖像半定量分析TGF-β1在正常肝細胞中極少量表達；模型組大鼠肝組織TGF-β1表達明顯增強，陽染細胞數(shù)目增多，呈棕黃色胞漿型分布；經(jīng)治療后，各治療組陽染程度較模型組均明顯減輕，陽染細胞數(shù)目明顯減少，以抑肝纖全方組減輕最明顯。免疫組化圖像半定量分析結(jié)果見表1。表1 各組大鼠肝組織TGF-β1蛋白表達結(jié)果比較(略)
2.2 肝組織PAI-1免疫組織化學(xué)染色及圖像半定量分析N組大鼠肝組織中PAI-1微弱表達；模型組大鼠肝組織PAI-1表達明顯增強，陽染細胞數(shù)目增多，PAI-1陽性染色為棕黃色。經(jīng)治療后，抑肝纖組、丹參、川芎組、黃芪、白術(shù)組陽染程度較模型組明顯減輕，以抑肝纖全方組減輕最明顯。鱉甲、牡蠣組減輕不明顯。免疫組化圖像半定量分析結(jié)果見表2。表2 各組大鼠肝組織PAI-1蛋白表達結(jié)果比較(略)
3 討論
中醫(yī)整體觀認為，人體是一個有機的整體，“肝病傳脾”“肝腎同源”及“肝膽表里”等臟腑關(guān)系，決定了肝臟病的中醫(yī)臟腑病機是以肝為中心、肝脾腎膽胃功能的失調(diào)。在治療肝臟疾病時，不能單純考慮肝之一臟，而應(yīng)注意調(diào)整肝臟與其他臟腑的關(guān)系，多層次多角度地考慮治肝方法。
抑肝纖針對慢性乙型肝炎肝纖維化本虛標實，虛淤共存，肝脾不和，氣滯血淤的病機，主要由益氣活血、軟堅散結(jié)等藥物組成。方中黃芪、白術(shù)益氣健脾，取“肝病實脾”之意；丹參為活血化淤良藥，古云：“一味丹參飲，功勝四物湯”，其活血作用可解肝郁，使血能養(yǎng)肝，正針對肝血淤這一肝纖維化關(guān)鍵；川芎辛散溫通，既能活血祛淤，又能行氣開郁，為血中之氣藥�！毒V目》謂川芎“肝苦急，以辛補之，故血虛者宜之，辛以散之，故氣郁者宜之”；柴胡舒肝解郁，宣暢氣血；鱉甲、牡蠣軟堅散結(jié)。方中各藥協(xié)同作用，用后使正氣旺盛，血行通暢，積塊自消。
肝星狀細胞（HSC）是調(diào)控肝臟ECM沉積的最重要細胞，其激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。TGF-β1是HSC產(chǎn)生ECM的主要刺激物。TGF-β1不僅促成HSC轉(zhuǎn)化為肌成纖維母細胞（MFB），而且能誘導(dǎo)ECM基因的表達上調(diào)，刺激ECM的合成，而刺激肝纖維化進程，如果阻斷TGF-β1合成可顯著降低肝纖維化［4］。研究還顯示，TGF-β1可抑制谷氨酰半胱氨酸連接酶的表達，促進肝細胞損害，還能抑制肝細胞DNA合成，阻止肝細胞再生［5］。
PAI-1屬絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族，PAI-1通過結(jié)合尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）抑制其纖溶激活作用，導(dǎo)致纖溶酶和基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)活性下調(diào)，ECM在肝內(nèi)沉積明顯增加。各種刺激因子使HSC 維持持續(xù)激活狀態(tài)，不斷分泌TGF-β1，可反饋性的引起PAI-1表達增加，已有研究表明［6，7］，通過抑制TGF-β1的信號傳導(dǎo)，可以減少HSCⅠ型膠原的蓄積，同時下調(diào)PAI-1的表達。TGF-β1，PAI-1在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，下調(diào)TGF-β，PAI-1表達，可能有助于抑制HSC的激（未完，下一頁）
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