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當(dāng)前位置：課件009首頁 >> 職教研究 >> 專業(yè)論文 >> 青天葵活性部位的體外抗腫瘤作用研究

青天葵活性部位的體外抗腫瘤作用研究 （作者未知）　2010/5/25 （接上頁）l、10% FBS（臨用前加）。 　　 1.2.2 DMEM完全培養(yǎng)液含DMEM培養(yǎng)基（GIBCO）、卡那霉素750μg/ml、10%FBS（臨用前加）。 　　 1.3 細胞株 白血病細胞株L1210和P388D1、宮頸癌細胞株Hela、人胃癌細胞株SGC7901、黑色素瘤細胞株B16、神經(jīng)腫瘤細胞株NG108-15等均購自上海細胞生物研究所細胞庫，人肝癌細胞株Hela7404由廣西醫(yī)科大學(xué)藥理教研室提供。 　　 1.4 試劑 　　 MTT（四甲基噻唑藍）為德國Sigma公司產(chǎn)品，批號020609；FBS（胚胎牛血清）為美國Hyclone公司產(chǎn)品，批號0405；RPMI1640和DMEM培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品，批號1120708和0311；Trypsin（胰蛋白酶）由天津市灝洋生物制品有限責(zé)任公司提供，批號200503；DMSO（二甲基亞砜）由天津匯英化學(xué)試劑有限公司提供，批號20040526。 　　 1.5 細胞培養(yǎng)腫瘤細胞用含10%滅活新生小牛血清的RPMI1640（NG108-15腫瘤細胞用DMEM）培養(yǎng)基在37℃，15%CO2條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。 　　 1. 6 儀器 　　 Thermo Forma型CO2培養(yǎng)箱，美國產(chǎn)；Olympus型倒置顯微鏡，日本產(chǎn)；Biocell型酶標(biāo)儀，奧地利產(chǎn)；AG135型電子天平，瑞士產(chǎn)；培養(yǎng)瓶，美國產(chǎn)；3072型96孔板，丹麥產(chǎn)；3001型培養(yǎng)皿，美國產(chǎn)；DLF560型超凈工作臺，荷蘭產(chǎn)；HV-50自動高壓滅菌器，日本產(chǎn)。 　　 2 方法 　　 2.1 樣品的提取分離 　　 將青天葵藥材陰干，去除雜質(zhì)，粉碎為粗粉，稱取9.0 kg藥材粗粉，用95%乙醇（食用）浸泡48 h后滲濾提取，用10倍量乙醇提取。合并乙醇提取液，減壓回收乙醇，得粗提物，干燥后得921.3 g（得膏率10.2%）。將所得的粗提物用硅膠拌勻后，依次用石油醚（60～90℃）、醋酸乙酯、正丁醇、甲醇回流提取，回收溶劑，得石油醚部位180 g，醋酸乙酯部位87.5 g，正丁醇部位86 g，甲醇部位50 g。 　　 2.2 MTT法 　　 取對數(shù)生長期細胞以0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化后，用培養(yǎng)液稀釋。在96孔培養(yǎng)板中每孔加入200 μl（含有5 000個/ml腫瘤細胞）含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，NG108-15細胞則用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，細胞置37℃，10%CO2培養(yǎng)24 h后，實驗組分別加入最終濃度為15，30，60，120，240 μg/ml提取物的培養(yǎng)液，對照組則加入等體積溶劑的培養(yǎng)液，每組4孔，重復(fù)4次。置37℃，10%CO2培養(yǎng)5 d后，棄去上清液，加入200 μl/孔新鮮配置的含0.2 mg/ml MTT的無血清培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入200 μl DMSO，振蕩混勻后，在酶標(biāo)儀上以波長為550 nm，參比波長為450 nm測定OD值。 　　 2.3 藥物對腫瘤細胞生長的抑制率的計算方法［5］ 　　 腫瘤細胞生長抑制率（%）=［（1-實驗組平均OD值）/對照組平均OD值］×100% 　　 2.4 半數(shù)抑制濃度ⅠC50的計算 　　 2.4.1 直線回歸法［6］ 　　 當(dāng)細胞生長抑制率與藥物濃度有對數(shù)關(guān)系時，以各個不同藥物的對數(shù)濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的細胞生長抑制率為縱坐標(biāo)，求出直線回歸方程，根據(jù)該方程計算出IC50。 　　 2.4.2 改良寇氏法［7］ 　　 當(dāng)細胞生長抑制率與藥物濃度不存在對數(shù)關(guān)系時，采用寇氏法計算IC50。藥物IC50值的公式為：IC50=lg-1［Xm-i (∑p-0.5)］。式中Xm：設(shè)計的最大濃度的對數(shù)值；i：相鄰兩組濃度對數(shù)值之差；∑p：各組生長抑制率之和；0.5：經(jīng)驗常數(shù)。 　　 3 結(jié)果 　　 3.1 不同濃度提取物對白血病細胞株L1210的抑制結(jié)果見表1。石油醚部位和醋酸乙酯部位對白血病細胞株L1210都有直接抑制作用，抑制率與提取物濃度成正比。細胞生長抑制率與藥液濃度無對數(shù)關(guān)系，故采用寇氏法計算IC50，IC50分別為83.5 μg/ml和76.2 μg/ml。正丁醇部位和甲醇部位對白血病細胞株L1210基本無活性。表1 受試樣品對白血病細胞株L1210抑制的影響(略) 　　 3.2 不同濃度提取物對白血病細胞株P(guān)388D1的抑制結(jié)果見表2。石油醚部位和醋酸乙酯部位對白血病細胞株P(guān)388D1都有直接抑制作用，抑制率與提取物濃度成正比。細胞生長抑制率與藥液濃度無對數(shù)關(guān)系，故采用寇氏法計算IC50。IC50分別為60.8 （未完，下一頁） 　　 頁碼選擇：1　2　3　4

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