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論視神經(jīng)離斷對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的影響
（作者未知） 2010/6/14
[論文關(guān)鍵詞]干細(xì)胞；組織培養(yǎng)；視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；細(xì)胞分化；
[論文摘要] 目的 探討大鼠視神經(jīng)離斷對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞一上丘組織共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化的影響。方法采用機(jī)械分離，無(wú)血清選擇培養(yǎng)的方法從孕14d的胚鼠上丘中獲取神經(jīng)干細(xì)胞并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。使用免疫熒光技術(shù)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。采用顯微手術(shù)的方法建立大鼠視神經(jīng)離斷模型，分別取正常大鼠、假手術(shù)和視神經(jīng)離斷大鼠的上丘組織進(jìn)行體外培養(yǎng)。使用組織一細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)將大鼠上丘組織與神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察干細(xì)胞分化過(guò)程，對(duì)分化細(xì)胞進(jìn)行鑒定，并與干細(xì)胞的自然分化過(guò)程進(jìn)行比較。結(jié)果從胚鼠上丘中獲得的細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)條件下聚集呈球形懸浮生長(zhǎng)，可形成單細(xì)胞克隆，具有多向分化能力，經(jīng)免疫熒光鑒定證實(shí)為神經(jīng)干細(xì)胞。視神經(jīng)離斷大鼠的上丘組織與胚胎上丘源神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分化，并誘導(dǎo)分化出Thyl.1陽(yáng)性的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。結(jié)論從胚胎大鼠上丘可以分離培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞，與視神經(jīng)離斷大鼠的上丘組織共培養(yǎng)可以誘導(dǎo)上丘源神經(jīng)干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。
1材料與方法
1.1主要材料和試劑
孕14d和3個(gè)月齡SD大鼠均由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。高糖DMEM／F12、Neurobasa1、N2、B27購(gòu)自美國(guó)Gibeo公司；EGF、b-FGF購(gòu)自美國(guó)R&D公司；小鼠抗Nestin單克隆抗體、小鼠抗Thyl.1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Chemieon公司；兔抗GFAP購(gòu)自武漢博士德公司；兔抗MAP-2單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。
1.2動(dòng)物分組與視神經(jīng)離斷模型
取3個(gè)月齡sD大鼠30只，雌雄不拘，隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組、假手術(shù)組和視神經(jīng)離斷組，每組動(dòng)物均為10只。視神經(jīng)離斷組大鼠隨機(jī)選擇一側(cè)眼，在手術(shù)顯微鏡下鈍性分離顯露視神經(jīng)；在離后極約2 mm處剪斷視神經(jīng)。術(shù)后于直接檢眼鏡下觀察視網(wǎng)膜血供良好者納入試驗(yàn)。假手術(shù)組動(dòng)物外科操作同視神經(jīng)離斷組，但不離斷視神經(jīng)。正常對(duì)照組則不做任何處理。
1.3胚胎上丘NSCS的分離與培養(yǎng)
取孕14d的SD大鼠，孕鼠孕齡的計(jì)算方法為：將雌雄大鼠合籠后，次晨檢查發(fā)現(xiàn)陰栓者為孕0天。按照大鼠腦解剖圖譜細(xì)心分離出上丘組織。胚胎上丘NSCS的分離與原代培養(yǎng)程序參見(jiàn)馮東福等已建立的方法。
1.4單細(xì)胞克隆及鑒定
將第2代的神經(jīng)干細(xì)胞球，吹打成單細(xì)胞懸液。使用連續(xù)稀釋法，最終細(xì)胞密度為100／ml。參照Reynolds和Weiss的方法，建立單細(xì)胞克隆。
使用細(xì)胞免疫熒光法對(duì)傳4代的細(xì)胞克隆進(jìn)行鑒定，一抗為小鼠抗Nestin單克隆抗體(1:100)，二抗為羊抗小鼠IgG Cy3(1:10)。使用TCS-SP2型激光共聚焦顯微鏡對(duì)熒光標(biāo)記后的細(xì)胞克隆球進(jìn)行觀察，并進(jìn)行計(jì)算機(jī)三維圖像重建，激發(fā)波長(zhǎng)為543mm。具體方法見(jiàn)馮東福等的報(bào)道。
1.5上丘組織培養(yǎng)
假手術(shù)組和視神經(jīng)離斷組大鼠在術(shù)后5d斷頭處死，取手術(shù)對(duì)側(cè)的上丘組織，正常對(duì)照組隨機(jī)取單側(cè)上丘組織。上丘組織培養(yǎng)采用我們已經(jīng)建立的方法。
1.6雙室組織一細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)
該系統(tǒng)由上下兩室組成。上室為透明PET微孔(孔徑0.4μm)濾膜培養(yǎng)小室(Becton Dickinson產(chǎn)品)，下室為配套的24孔培養(yǎng)板，可將上室懸吊起來(lái)。共培養(yǎng)時(shí)將上下室組合起來(lái)。
1.7神經(jīng)干細(xì)胞的自然分化
取傳4代的NSCS懸液，從500r／min離心5min，棄上清，加入干細(xì)胞分化培養(yǎng)液(Neurobasal培養(yǎng)液+B27(1：50)+10％FBS+谷氨酰胺4 mmol／L)輕柔吹打。調(diào)整細(xì)胞密度為1×105／ml后將1 ml懸液滴入下室，上室中不放組織塊，僅加入分化培養(yǎng)液。把接種后的雙室組織一細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)放人C02培養(yǎng)箱中于37℃ 、5％CO2條件下貼壁培養(yǎng)。隔日用相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)分化情況，貼壁培養(yǎng)14d后進(jìn)行熒光免疫細(xì)胞化學(xué)染色。1.8上丘組織一神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化
將傳4代的NSCS懸液以500r／min離心5min，棄上清，加入分化培養(yǎng)液輕柔吹打，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105／ml后取1ml懸液滴入下室中于37℃ 5％C02條件下貼壁培養(yǎng)。3d后將已在體外培養(yǎng)4d的上丘組織移入共培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行共培養(yǎng)。6d后將上室移去，神經(jīng)干細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至14d。
1.8分化細(xì)胞的鑒定
細(xì)胞免疫熒光染色步驟同前，根據(jù)需要上不同的一抗，抗體工作濃度分別為：MAP-2(1:50)、GFAP(1:100)、Thy（未完，下一頁(yè)）
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