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論視神經(jīng)離斷對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的影響
（作者未知） 2010/6/14
（接上頁(yè)）l.1(1:100)。根據(jù)不同的一抗選擇FITC或Cy3熒光二抗。陰性對(duì)照使用PBS液代替一抗。對(duì)Thyl.1陽(yáng)性的培養(yǎng)孔，每孔隨機(jī)選擇3個(gè)克隆，在細(xì)胞疏松區(qū)域選擇4個(gè)不同視野，記數(shù)總細(xì)胞數(shù)和Thyl.1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性率。
2 結(jié)果
2.1 上丘神經(jīng)干細(xì)胞克隆形成及鑒定
大鼠胚胎上丘細(xì)胞接種48h后培養(yǎng)液明顯黃變，大部分細(xì)胞死亡，存活的部分細(xì)胞胞體增大，折光性增強(qiáng)，伴有明顯光暈。部分細(xì)胞出現(xiàn)分裂相，細(xì)胞可成對(duì)出現(xiàn)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞團(tuán)逐漸增大，呈球形懸浮生長(zhǎng)，邊緣細(xì)胞折光性較強(qiáng)。對(duì)第2代細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞克隆培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞可形成亞克隆，這些來自單個(gè)細(xì)胞的亞克隆可以進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并大量增殖。
使用激光共聚焦顯微鏡，進(jìn)行三維重建后可以清晰地看到克隆球呈Nestin陽(yáng)性，中心的細(xì)胞較為
2.2分化細(xì)胞的鑒定
NSCS的自然分化和各共培養(yǎng)組合誘導(dǎo)分化分化情況。各組神經(jīng)干細(xì)胞大部分均分化為GFAP陽(yáng)性的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。少量分化為MAP-2陽(yáng)性的神經(jīng)元。但只有上丘源NSCS與視神經(jīng)離斷組的上丘組織共培養(yǎng)后可見有Thyl.1陽(yáng)性的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分化。在該組分化的細(xì)胞中，Thyl.1陽(yáng)性細(xì)胞的比率為14.92％
2.3神經(jīng)干細(xì)胞的自然分化
神經(jīng)干細(xì)胞克隆在撤除絲裂原24h后貼壁。隨著時(shí)問延長(zhǎng)克隆球逐漸變扁平，并以克隆為中心產(chǎn)生放射狀細(xì)胞遷移�？寺∏蜻吘壍募�(xì)胞形狀較不規(guī)則，多數(shù)細(xì)胞呈梭形或多角形，發(fā)出短而細(xì)的突起。7d后部分細(xì)胞可見長(zhǎng)突起，細(xì)胞的折光性也各有不同。在相差顯微鏡下可見胞體較疏松，邊緣部分有散在的遷移細(xì)胞，部分細(xì)胞可見有突起發(fā)出，亦呈Nestin陽(yáng)性。 大、形態(tài)不規(guī)則、具有多個(gè)粗突起的膠質(zhì)樣細(xì)胞數(shù)量較多。而胞體有很強(qiáng)光暈，呈圓形或橢圓形、具有1～2個(gè)細(xì)長(zhǎng)突起的神經(jīng)元樣細(xì)胞數(shù)量較少。隨著神經(jīng)干分化時(shí)間的延長(zhǎng)，克隆球四周的細(xì)胞逐漸增多，遷移的距離也逐漸增加。在培養(yǎng)2周時(shí)出現(xiàn)大量細(xì)胞遷移，而克隆球邊緣則逐漸模糊
2.4組織-神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化
上丘神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)與組織共培養(yǎng)24h后均貼壁生長(zhǎng)，克隆球逐漸變扁平。部分克隆球邊緣有細(xì)胞突起發(fā)出，開始分化過程。在培養(yǎng)48h后可見細(xì)胞向外遷移，在相差顯微鏡下呈明顯的“太陽(yáng)征”在培養(yǎng)5d時(shí)，以克隆為中心產(chǎn)生的
3 討論
雖然干細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化已經(jīng)有較多研究，但在體外誘導(dǎo)NSCS向RGCs分化，特別是采用上丘組織與NSCS共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化的研究目前還未見報(bào)道。筆者采用了一種新型的雙室共培養(yǎng)誘導(dǎo)NSCS分化模式，細(xì)胞與組織不在一個(gè)平面上。下室為多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)板，用于細(xì)胞培養(yǎng)。上室底部的PET膜使用細(xì)胞外基質(zhì)包被，并經(jīng)過蝕刻處理，有利于細(xì)胞的遷移，其組織貼壁率明顯優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)載體。組織接種到小室底部PET膜上后，與下室組合在一起進(jìn)行共培養(yǎng)。由于PET膜上分布的孔徑為0.4μm，所以膜上細(xì)胞分泌的分子會(huì)穿過PET膜孔到達(dá)下面，但細(xì)胞卻無(wú)法進(jìn)行直連續(xù)放射狀細(xì)胞遷移，這些細(xì)胞的形態(tài)大多是圓形或梭形，多數(shù)細(xì)胞有較長(zhǎng)突起，也有一些細(xì)胞體未見明顯突起長(zhǎng)。在培養(yǎng)2周后，大部分克隆明顯減小，而不同克隆分化出的細(xì)胞交織成網(wǎng)，細(xì)胞間的突起相互連接。接接觸，因此可以排除細(xì)胞接觸因素的影響。
在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中，各種神經(jīng)元與對(duì)應(yīng)的靶組織建立突觸聯(lián)系往往是其存活和進(jìn)一步成熟分化的重要條件。大鼠出生時(shí)視覺系統(tǒng)尚未成熟，視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，特別是節(jié)細(xì)胞，在出生后的成熟和分化，皆有賴于其靶組織一中腦上丘提供神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和誘向因子。因此筆者通過將NSCS與RGCS的靶組織共培養(yǎng)的方法，探討靶組織在體外環(huán)境下對(duì)NSCS分化的影響。筆者發(fā)現(xiàn)視神經(jīng)離斷成年大鼠的上丘組織均可誘導(dǎo)NSCS分化為RGCS，而假手術(shù)組和正常對(duì)照組的上丘組織則無(wú)此作用。
上丘對(duì)RGCS的作用是通過一系列復(fù)雜的化學(xué)因子調(diào)節(jié)的，其中較為重要的是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的作用。Frost等報(bào)道在上丘中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因于的表達(dá)水平與RGCS發(fā)育程度相關(guān)，出生后15d內(nèi)的倉(cāng)鼠上丘B(yǎng)DNF保持在較高水平，而在成年期其含量下降約1／3左右。Kretz等則發(fā)現(xiàn)另一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子——睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在發(fā)育期上丘的表達(dá)也具有同樣的時(shí)間依賴性。這些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在發(fā)育期的高表達(dá)，對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化同樣具有重要作用。筆者從胚胎大鼠上丘組織中成功分離出具有多向分化能力的NSCS，也說明發(fā)育期的上丘組織存在NSCS存活、分化的微環(huán)境。
但對(duì)于成年動(dòng)物，上丘對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞的促進(jìn)生長(zhǎng)作用逐漸消失。而在視神經(jīng)離斷后，上丘可以再現(xiàn)胚胎期對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)（未完，下一頁(yè)）
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